NeuroCog II scRNA-Seq Lab
Loyal Goff
2/21/2019
Dataset description
These data were generated by the Goff and Brown labs as preliminary data for a project to understand the cell type-specific differences in gene expression in the developing and adult motor cortex of a mouse model of familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Dissected M1 cortices were enzymatically dissociated and used as input for the 10x Genomics 3’ Gene Expression Profiling system (V2).
10x Genomics sequencing workflow overview
- Whole dissociated postnatal day 6-7 motor cortex
- \(n=5\) replicates each of wild type and a human C9orf72 pathogenic repeat BAC transgenic line (C9-500-BAC)
- 10x Genomics 3’ Gene Expression analysis
- ~8000 cells targeted per replicate
- 10 samples sequenced on 1 NovaSeq 6000 S1 Flowcell
- ~1.6B reads
- Standard demuxing and preprocessing with 10x genomics Cellranger (v2.2) software tool
Data availability
Interactive dataset browser: http://neurocoglab.gofflab.org
Code/scripts to reproduce todays lab: https://github.com/gofflab/neurocog_scRNA_seq
Data link: https://drive.google.com/open?id=1sSoBnsXhOrLTC-EsTdSk18h4lEiZHQ8D
Objectives for Today
- Import/clean preprocessed scRNA-Seq data into Monocle Framework (R/Bioconductor)
- QC analysis of cell and gene quality
- Dimensionality reduction
- Clustering
- Cell type annotation
- Intro to Differential Expression
- Pattern discovery & annotation
Importing Preprocessed Data
This tutorial assumes that we have already performed the initial preprocessing of the data using the cellRanger pipeline from 10x Genomics. One of the main results of this preprocessing is a \(genes X cells\) matrix of Unique Molecular Identifier (UMI) counts. E.g.:
| cell1 | cell2 | cell3 | |
|---|---|---|---|
| gene1 | 0 | 2 | 0 |
| gene2 | 15 | 7 | 3 |
| gene3 | 1 | 0 | 2 |
…
So let’s import the raw count data from the cellRanger output. The key files here are matrix.mtx, barcodes.tsv, and genes.tsv.
cellranger_dir <- 'data/10x/preprocessed'
raw <- load_cellranger_matrix(cellranger_dir)## Searching for genomes in: data/10x/preprocessed/outs/filtered_gene_bc_matrices_mex
## Using mm10 in folder: data/10x/preprocessed/outs/filtered_gene_bc_matrices_mex/mm10
## Loaded matrix information
## Loaded gene information
## Loaded barcode information
## Could not find summary csv:
## data/10x/preprocessed/outs/metrics_summary.csv.
## This file is only necessary if you are performing depth-normalization (calling the equalize_gbms function) in R.
## If this pipestance was produced by `cellranger aggr` with the default parameters, depth-normalization in R (via equalize_gbms) is not necessary.#saveRDS(raw,'data/raw.rds')raw## GeneBCMatrix (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 55371 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: AAACCTGAGACACTAA-1 AAACCTGAGACCCACC-1 ...
## TTTGTCATCTCCGGTT-10 (55371 total)
## varLabels: barcode
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: id symbol
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:Data cleaning and Annotation
We would also like to add a bit of external information about the genes and samples (cells) to help us make some better interpretations downstream. This annotation corresponds to metadata about how and when the samples were processed, as well as some of the important parameterizations for our experimental questions.
# Prep for CDS
fd <- fData(raw)
#change default feature column names to Monocle-friendly terms
colnames(fd) <- c("gene_id","gene_short_name")
# Prep for CDS
pd <- pData(raw)
# Extract sample 'number' information from barcode (cell_id) substring
pd$sample_num<-as.numeric(str_sub(pd$barcode, start= 18))Merge in external annotations
sample_info<-read.csv('data/annotation/sample_aggregation.csv',header=T)
#sample_info<-sample_info[,-2]
master_sample_sheet<-read.csv('data/annotation/sample_info.csv',header=T)
#Merge cellranger aggr data with external annotation
sample_info<-merge(sample_info,master_sample_sheet,by.x="library_id",by.y="sample_id",sort = FALSE)
DT::datatable(sample_info)#Merge all annotation with pd
pd<-merge(pd,sample_info,by.x='sample_num',by.y=0,sort=F)
rownames(pd)<-pd$barcodeThe CellDataSet object
Many R packages for high-throughput sequencing data use a general structure for data organization (Class) derived from the Bioconductor ExpressionSet object. The Monocle package defines the CellDataSet class, which inherits from ExpressionSet, to hold and manipulate single cell RNA-Seq data. The layout of a CDS object is roughly as follows:
Schematic of the Monocle CellDataSet class
Here we create the Monocle CellDataSet object from our imported, cleaned, and annotated data. This is the data object that we will be modifying/exploring for the rest of the tutorial.
Create monocle CDS object
dat <- newCellDataSet(exprs(raw),
phenoData = new("AnnotatedDataFrame", data = pd),
featureData = new("AnnotatedDataFrame", data = fd),
lowerDetectionLimit = 0.5,
expressionFamily = negbinomial.size())
dat## CellDataSet (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 55371 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: AAACCTGAGACACTAA-1 AAACCTGAGACCCACC-1 ...
## TTTGTCATCTCCGGTT-10 (55371 total)
## varLabels: sample_num barcode ... Size_Factor (26 total)
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: gene_id gene_short_name
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:Subsetting cells
For the exclusive purposes of this lab, and to allow for things to run in a reasonable timeframe, we are going to reduce the number of cells we will consider randomly by ~ 90%. (This is not normally done, but we won’t get through much in this lab unless we cull).
#sampleFactor<-0.1
#sampleCellBarcodes<-sample(rownames(pData(dat)),dim(dat)[2]*sampleFactor)
#write.csv(sampleCellBarcodes,'data/annotation/sampleCellBarcodes.csv')sampleCellBarcodes<-read.csv('data/annotation/sampleCellBarcodes.csv',stringsAsFactors = FALSE)$x
dat<-dat[,sampleCellBarcodes]
dat## CellDataSet (storageMode: environment)
## assayData: 27998 features, 5537 samples
## element names: exprs
## protocolData: none
## phenoData
## sampleNames: ACACCGGTCACTTCAT-10 TCGTAGAAGCTAAACA-6 ...
## GTTACAGAGTGTACTC-4 (5537 total)
## varLabels: sample_num barcode ... Size_Factor (26 total)
## varMetadata: labelDescription
## featureData
## featureNames: ENSMUSG00000051951 ENSMUSG00000089699 ...
## ENSMUSG00000095742 (27998 total)
## fvarLabels: gene_id gene_short_name
## fvarMetadata: labelDescription
## experimentData: use 'experimentData(object)'
## Annotation:Data QC and Filtering
Before we move on to exploration and annotation of the data, we first need to get some summary statistics such as a scaling factor and an estimate of the dispersion for each gene (variance in excess of what is expected for a given model fit).
dat<-estimateSizeFactors(dat)
dat<-estimateDispersions(dat,cores=4)## Processing block 1/1 ... OK## Warning in log(ifelse(y == 0, 1, y/mu)): NaNs produced## Warning: step size truncated due to divergence## Removing 79 outliers#saveRDS(dat,'data/dat.rds')Gene QC metrics
Minimum number of cells expressing a given gene
It’s a good idea, and saves time/effort to identify and only consider genes whose expression levels are detected in a certain number or proportion of cells within your assay.
dat<-detectGenes(dat)
cellCutoff<-20
expressed_genes <- row.names(subset(fData(dat),
num_cells_expressed >= cellCutoff))
hist(fData(dat)$num_cells_expressed,col="red",breaks=50,main="Number of cells expressing a given gene")
hist(log10(fData(dat)$num_cells_expressed),col="red",breaks=50,main="Number of cells expressing a given gene")
abline(v=log10(cellCutoff),lty="dashed")
We have now identified a total of 14241 that are detectably expressed in at least 20 cells in our dataset.
Distribution of gene mean copies per cell
What is the average expression level (in mRNA Copies per cell) for each gene?
fData(dat)$mean_cpc<-Matrix::rowMeans(exprs(dat))
hist(log10(fData(dat[expressed_genes,])$mean_cpc),col="purple",breaks=50,main="Mean RNA copies per cell")
Cell QC metrics
Distribution of detected genes across cells
How many genes are expressed in a given cell?
hist(pData(dat)$num_genes_expressed,col="darkgreen",breaks=50,main="Number of genes expressed per cell")
Mt-genome proportion
A high proportion of mitochondrial genes may indicate a lower than ideal capture efficiency for a given cell.
mito_genes<-fData(dat)$gene_id[grepl("^mt-",fData(dat)$gene_short_name)]
pData(dat)$mt_reads <- Matrix::colSums(exprs(dat)[mito_genes,])
pData(dat)$total_reads <- Matrix::colSums(exprs(dat))
pData(dat)$mito_ratio <- pData(dat)$mt_reads/pData(dat)$total_reads
ggplot(pData(dat),
aes(x = num_genes_expressed, y = mito_ratio)) +
geom_point() +
labs(x = "Number of genes", y = "Mitochondrial ratio") +
scale_color_brewer(palette = "Set1") +
theme(legend.position = "none") +
monocle:::monocle_theme_opts()
Total mRNAs per cell
To get a general picture of the capture efficiency and depth of information for each cell we can look at the total mRNA mass recovered per cell.
pData(dat)$Total_mRNA<-Matrix::colSums(exprs(dat))
hist(pData(dat)$Total_mRNA,col="darkblue",breaks=50,main="Total mRNAs sequenced per cell")
Bonus question: How many mRNAs do we expect are in a given eukaryotic cell?
For each of the above QC ‘criterion’ we can define thresholds that can be used to filter cells/genes to improve the quality of the dataset. Here is usually where obvious doublet cells (more than one cell is associated with a single barcode sequence) or low-quality cells are removed prior to doing any further statistical interpretations.
Selection of High-Variance Genes
Per-gene technical variance in scRNA-Seq data is well modeled by a negative binomial fit.
Genes with excess variation (overdispersion) should have high biological variation above and beyond the modeled technical variance.
We select this subset to highlight differences between cell types and states for downstream analyses.
disp_table = dispersionTable(dat)
disp_table = disp_table %>% mutate(excess_disp =
(dispersion_empirical - dispersion_fit) / dispersion_fit) %>%
arrange(plyr::desc(excess_disp))
expression_cutoff<-1e-04
top_subset_genes = intersect(fData(dat)$gene_id[fData(dat)$mean_cpc>=expression_cutoff],disp_table$gene_id[disp_table$excess_disp>0])
#top_subset_genes = as.character(head(disp_table, 1000)$gene_id)
dat <- setOrderingFilter(dat, top_subset_genes)
plot_ordering_genes(dat)## Warning: Transformation introduced infinite values in continuous y-axis
Monocle Preprocessing
Standard secondary preprocessing for single cell RNA-Seq involves projecting expression data into the top principal components to identify ranked sources of variation. This is usually done after log-transforming the data to stabilize the variance across the dynamic range of gene expression. Monocle conveniently provides a function preprocessCDS() that will do this transform and PCA analysis.
#log-transform and initial PCA
dat <- preprocessCDS(dat, method = 'PCA',
norm_method = 'log',
num_dim = 25, #Arbitrary....I should look at scree plot.
verbose = T)## Remove noise by PCA ...## Processing block 1/1 ... OKplot_pc_variance_explained(dat,max_components=50)## Processing block 1/1 ... OK
By looking at a scree-plot of the variance explained by each component, you can pick a reasonable threshold number of components to incorporate into the downstream analysis. Here we have chosen 25 components as slightly past the tangent point for the curve.
Dimensionality Reduction
A crucial next step is to summarize the set of significant learned principal components into an interpretable set of dimensions (e.g. 2). You may recognize these as t-SNE plots, although a more robust, faster, and appropriate algorithm Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) is currently being promoted.
#UMAP dimensionality reduction
dat <- reduceDimension(dat, max_components = 2,
reduction_method = 'UMAP',
metric="correlation",
#metric="cosine",
#min_dist = 0.75,
#n_neighbors = 50,
verbose = T
)## Retrieving normalized data ...## Running Uniform Manifold Approximation and ProjectionCell Clustering
Our next task is to find and annotate groups of cells with similar transcriptional profiles. To do this, we will use a fast and robust ‘community detection algorithm’ called Louvain clustering.
dat <- clusterCells(dat,
method = 'louvain',
res = 1e-3,
#res = NULL,
louvain_iter = 1,
verbose = T)## Run kNN based graph clustering starts:
## -Input data of 5537 rows and 2 columns
## -k is set to 20## Finding nearest neighbors...DONE ~ 0.022 s
## Compute jaccard coefficient between nearest-neighbor sets ...DONE ~ 0.007 s
## Build undirected graph from the weighted links ...DONE ~ 0.026 s
## Run louvain clustering on the graph ...
## Running louvain iteration 1 ...## Current iteration is 1; current resolution is 0.001; Modularity is 0.893428684149716; Number of clusters are 18## Maximal modularity is 0.893428684149716; corresponding resolution is 0.001##
## Run kNN based graph clustering DONE, totally takes 0.38129711151123 s.## -Number of clusters: 18And now lets see what our learned clusters/communities look like. Remember, at this point, we haven’t looked for or filtered for a single marker gene to identify cell types. This is part of the power of using the aggregate transcriptional profile (well, high-variance genes at least) to identify these clusters in an unbiased manner.
Visualizations
cell_size<-0.5
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
plot_cell_clusters(dat,color="Genotype", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("red","grey40"))
plot_cell_clusters(dat,color="Sex", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("orange","darkblue"))
plot_cell_clusters(dat,color="library_id", cell_size=cell_size)
pdf("figures/initial_clustering.pdf")
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
plot_cell_clusters(dat,color="Genotype", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("red","grey40"))
plot_cell_clusters(dat,color="Sex", cell_size=cell_size) + scale_color_manual(values=c("orange","darkblue"))
plot_cell_clusters(dat,color="library_id", cell_size=cell_size)
dev.off()## quartz_off_screen
## 2Embedding shapes
- Sometimes, clearly defined cell types are obvious puncta in a 2D embedding
- Other times, what you think of as a single cell type may be broken up into several ‘subtypes’
- Still more, a single cell ‘type’ may consist of several ‘cell states’ that might present as more of an amorphous shape in an embedding
- Cells in an ergodic transitioning state may be represented as a ‘pseeudotemporal trajectory’ as different cells pass through different phases of the transition.
- These trajectories can be very useful as a high-resolution timecourse for how cells respond to changes or cues.
- What types of shape:stories might be represented in these clusters? What cell types do we expect to find in a P6-7 mouse motor cortex?
Annotating cells by marker gene expression
Some (not all) of the markers came from here http://casestudies.brain-map.org/celltax
First, we will make a few plots with known marker(anchor) genes to place some of the learned clusters into their biological contexts.
pdf("figures/Markers.pdf",width=15,height=15)
#Interneuron markers
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gad1","Vip","Chat","Sst","Lhx6","Pvalb","Htr3a"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Interneurons") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gad2","Pvalb","Sst","Vip","Ndnf","Cck"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Interneurons-Level 1 Markers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Excitatory markers
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Slc17a6","Slc17a7","Rorb","Ctgf"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Pyramidals") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Pantr1","Cux2","Satb2"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Upper layers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Cdh13","Ctgf","Tle4","Bcl11b"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Deep layers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Cux2","Nr5a1","Scnn1a","Tg3","Rorb","Tg2","Rbp4","Ntsr1","Ctgf","Cdh13","Chrna6"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory - Rough Laminar Markers") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.plot_cell_clusters(dat, markers=c("Sla","S100a3","Macc1","Olfr78","Wfdc18","Wfdc17","Aldh1a7","Oprk1","Rgs8","Htr2c","Hpgd","Sdc1","Trh","Cpa6","Ppp1r18","Fam150a","F2r","P2ry12","Mup3"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Excitatory - ALM Excitatory markers Economo et al") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Brain Fibroblasts
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Lum","Col1a1","Lama1","Efemp1","Dcn","Col6a1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Brain Fibroblasts") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Vascular endothelium
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Vwf","Kit","Flt1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Vascular Endothelium") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Vascular Smooth muscle
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Bgn"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Vascular Smooth Muscle") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Astrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Gfap","Slc1a3","Aqp4"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Astrocytes") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Neural progenitors
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Fabp7","Pax6","Sox2","Hes5","Nes","Eomes","Id2","Msi1","Sox1","Igfbpl1","Riiad1","Top2a","Ascl1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Neural Progenitors") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Oligodendrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Mbp","Mobp","Pdgfra","Bmp4","Tmem2"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Oligodendrocytes") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Microglia
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Ctss"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Microglia") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.# Erythrocytes
plot_cell_clusters(dat, markers=c("Hbb-bt","Hbb-bs","Hba-x","Hba-a1"), cell_size=cell_size) + ggtitle("Erythrocytes")## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.dev.off()## quartz_off_screen
## 2plot_cell_clusters(dat, markers=c("Slc17a6","Slc17a7","Rorb","Ctgf"), cell_size=1) + ggtitle("Pyramidals") + coord_equal(1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
The expression of these known marker genes across clusters can be used to infer celltype:cluster associations.
Cluster-specific marker genes
Similar to differential expression, we can identify novel marker genes for individual clusters. We can do this using Moran’s I test for spatial autocorrelation in the 2D UMAP embedding. First we must learn the relationship between cells in the UMAP embedding. We do this by first learning a principal graph structure and identify genes with significant spatial autocorrelation along the graph using principalGraphTest(). We will use the results of the Moran’s I test as a ‘relatedness’ filter for putative marker genes for each cluster.
#Takes ~45 min to run...
start <- Sys.time()
spatial_res <- principalGraphTest(dat[expressed_genes,], relative_expr = TRUE, k = 10, cores = 6,verbose=TRUE)## retrieve the matrices for Moran's test...## Performing Moran's test: ...##
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| | 0%, ETA NA
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| | 0%, ETA 05:29:54
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| | 0%, ETA 01:24:01
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| | 0%, ETA 51:53
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| | 0%, ETA 48:27
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| | 0%, ETA 50:44
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| | 1%, ETA 47:27
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| | 1%, ETA 52:28
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| | 1%, ETA 56:29
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| | 1%, ETA 56:52
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| | 1%, ETA 57:12
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| | 1%, ETA 57:17
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|= | 1%, ETA 56:07
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|= | 1%, ETA 57:43
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|= | 1%, ETA 57:34
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|= | 1%, ETA 57:26
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|= | 1%, ETA 57:48
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|= | 1%, ETA 58:00
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|= | 1%, ETA 58:28
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|= | 1%, ETA 58:56
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|= | 1%, ETA 59:29
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|= | 1%, ETA 01:02:44
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|= | 1%, ETA 01:01:37
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|= | 1%, ETA 59:07
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|= | 2%, ETA 57:33
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|= | 2%, ETA 53:18
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|= | 2%, ETA 52:06
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|= | 2%, ETA 52:03
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|= | 2%, ETA 52:37
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|= | 2%, ETA 52:49
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|= | 3%, ETA 53:30
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|= | 3%, ETA 53:11
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|= | 3%, ETA 52:30
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|== | 3%, ETA 52:02
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|== | 3%, ETA 51:30
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|== | 3%, ETA 50:29
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|== | 3%, ETA 48:59
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|=== | 5%, ETA 47:08
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|===================================================== | 97%, ETA 01:26
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|===================================================== | 97%, ETA 01:24
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|===================================================== | 97%, ETA 01:22
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|===================================================== | 97%, ETA 01:21
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|===================================================== | 97%, ETA 01:20
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|===================================================== | 97%, ETA 01:19
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|===================================================== | 97%, ETA 01:13
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|===================================================== | 97%, ETA 01:10
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|===================================================== | 97%, ETA 01:08
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|===================================================== | 97%, ETA 01:08
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|====================================================== | 97%, ETA 01:07
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|====================================================== | 97%, ETA 01:06
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|====================================================== | 97%, ETA 01:05
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|====================================================== | 97%, ETA 01:03
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|====================================================== | 97%, ETA 01:02
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|====================================================== | 98%, ETA 01:02
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|====================================================== | 98%, ETA 01:00
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|====================================================== | 98%, ETA 00:59
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|====================================================== | 98%, ETA 00:57
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|====================================================== | 98%, ETA 00:56
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|====================================================== | 98%, ETA 00:55
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|====================================================== | 98%, ETA 00:53
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|====================================================== | 98%, ETA 00:52
|
|====================================================== | 98%, ETA 00:50
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|====================================================== | 98%, ETA 00:49
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|====================================================== | 98%, ETA 00:48
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|====================================================== | 98%, ETA 00:46
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|====================================================== | 98%, ETA 00:45
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|====================================================== | 98%, ETA 00:43
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|====================================================== | 98%, ETA 00:42
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|====================================================== | 98%, ETA 00:40
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|====================================================== | 98%, ETA 00:39
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|====================================================== | 98%, ETA 00:38
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|====================================================== | 98%, ETA 00:37
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|====================================================== | 99%, ETA 00:37
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|====================================================== | 99%, ETA 00:36
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|====================================================== | 99%, ETA 00:35
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|====================================================== | 99%, ETA 00:33
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|====================================================== | 99%, ETA 00:32
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|====================================================== | 99%, ETA 00:31
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|====================================================== | 99%, ETA 00:29
|
|====================================================== | 99%, ETA 00:28
|
|====================================================== | 99%, ETA 00:27
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|====================================================== | 99%, ETA 00:25
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|====================================================== | 99%, ETA 00:24
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|====================================================== | 99%, ETA 00:23
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:22
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:21
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:20
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:19
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:17
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:16
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:14
|
|=======================================================| 99%, ETA 00:13
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:12
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:11
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:09
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:08
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:07
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:06
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:05
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:03
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:02
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:01
|
|=======================================================| 100%, ETA 00:00## returning results: ...end <- Sys.time()
end - start## Time difference of 41.01174 minsThen we can calculate the specificity score for each gene as well. \(S_{g,i}=1-\sqrt{H(\frac{\sum_{1}^{n} p_g q_i}{n}) - \sum_{1}^{n} \frac{H(p_g q_i)}{n}}\)
system.time(cluster_marker_res <-
find_cluster_markers(dat[expressed_genes,],
spatial_res,
group_by = 'Cluster',
morans_I_threshold = 0.25,
verbose=TRUE))## user system elapsed
## 11.409 1.910 13.510Now we can take a look a the the genes that are most specific for each of the annotated clusters. This will help us with identifying cell types.
genes <-
(cluster_marker_res %>%
dplyr::filter(mean > 0.5, percentage > 0.1) %>%
dplyr::group_by(Group) %>%
dplyr::top_n(1, wt = specificity))
options(repr.plot.width=22, repr.plot.height=12)
plot_markers_by_group(dat[expressed_genes,], genes$gene_short_name, group_by = 'Cluster', ordering_type = 'maximal_on_diag')## Warning in if (axis_order == "marker_group") {: the condition has length >
## 1 and only the first element will be used
pdf("figures/cluster_markers.pdf",width=7,height=6)
plot_markers_by_group(dat[expressed_genes,], genes$gene_short_name, group_by = 'Cluster', ordering_type = 'maximal_on_diag')## Warning in if (axis_order == "marker_group") {: the condition has length >
## 1 and only the first element will be useddev.off()## quartz_off_screen
## 2Here are the top 10 specific genes for each learned cluster
nGenesPerGroup<-10
top_n_genes <-
(cluster_marker_res %>%
dplyr::filter(mean > 0.5, percentage > 0.1) %>%
dplyr::group_by(Group) %>%
dplyr::top_n(nGenesPerGroup, wt = specificity))
DT::datatable(top_n_genes)groupOfInterest<-8
marker_genes <- top_n_genes$gene_short_name[top_n_genes$Group==groupOfInterest][1:4]
plot_cell_clusters(dat,
markers = as.character(marker_genes),
show_group_id = T, cell_size = 1)## Warning: Using alpha for a discrete variable is not advised.
Major cell type annotation
Using insights from known and novel marker genes, we can annotate individual clusters as containing major cell types as follows:
#These will have to be manually assigned after each new clustering solution
plot_cell_clusters(dat,color="Cluster", cell_size=cell_size, show_group_id = T) + guides(color=FALSE) + coord_equal(1)
pData(dat)$CellType<-"Unknown"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(8,16)] <- "Oligodendrocyte"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(7)] <- "Astrocyte/Radial Glia"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(5,10,14,18)] <- "Interneurons"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(1,2,3,4,6)] <- "Excitatory Neurons"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(13)] <- "Microglia"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(11)] <- "Vascular Endothelium"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(17)] <- "Vascular Smooth Muscle"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c()] <- "Cycling Neural Progenitor"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(12)] <- "Brain Fibroblasts"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c()] <- "Doublets"
pData(dat)$CellType[pData(dat)$Cluster %in% c(15)] <- "RBCs"
colorCount <- length(unique(pData(dat)$CellType))
getPalette <- colorRampPalette(brewer.pal(9, "Set1"))
p<-plot_cell_clusters(dat,color="CellType",cell_size=0.8, show_group_id = TRUE) + scale_color_manual(values=getPalette(colorCount)) + coord_equal(1)
p
#Save to .pdf
pdf("figures/Major_celltype.pdf",width=12,height=8)
p
dev.off()## quartz_off_screen
## 2Recursive analysis and annotation of sub-celltypes
- Different major cell types have different degrees of heterogeneity
- interneuron subtypes appear quite distinct
- several ‘types’ of pyramidals blend together
- Neural progenitors and Oligos (at P6) appear to be drawn out in a linear fashion
- Current best practices include recursive analysis of major cell types
- ‘high-variance’ genes will change if you refine your scope to only focus on one ‘major cell type’
- can resolve sub-celltypes or otherwise hidden cell states.
Differential Testing
Often, we design our experiments to explicitly ask refined and focused questions about differential gene expression. Monocle includes a powerful gene expression testing framework to help you find genes that are differentially expressed between groups of cells and assesses their statistical signficance. Grouping information (or other continuous parameters for your modeling) are stored in the phenoData (pData) table of each CellDataSet. Any column in pData can be added to the linear model(s). Monocle will test the signficance of each gene’s expression level across the different groups of cells defined by the comparison of two models. Monocle uses the likelihood ratio test to compare two linear models (full vs reduced) for a given gene to determine whether the parameters lost in the reduced model explain a significant amount of variance in the data.
#Takes ~6-8 minutes to run...
system.time(CellType_DE_genes<-differentialGeneTest(dat[expressed_genes],fullModelFormulaStr = "~num_genes_expressed+CellType",reducedModelFormulaStr = "~num_genes_expressed",cores=6,verbose=TRUE))## user system elapsed
## 1695.546 419.554 415.581sigCutoff<-1.0e-9
CellType_sigGeneIDs<-rownames(CellType_DE_genes[CellType_DE_genes$qval<=sigCutoff,])
CellType_sigGenes<-CellType_DE_genes[CellType_DE_genes$qval<=sigCutoff,"gene_short_name"]
length(CellType_sigGenes)## [1] 6613#pdf("figures/CellType_sigGenes_jitter_by_cluster.pdf",width=10,height=5)
#gene_logfc_easy_jitter(dat,CellType_sigGenes, celltypes = unique(pData(dat)$CellType))
#dev.off()Below is a table of all significantly differentially expressed genes ($p $ rsigCutoff) between major CellTypes.
sigTable<-CellType_DE_genes[order(CellType_DE_genes$qval,decreasing=FALSE),]
DT::datatable(sigTable[sigTable$qval <= sigCutoff,])## Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too
## big for client-side DataTables. You may consider server-side processing:
## https://rstudio.github.io/DT/server.htmlPattern Discovery (NMF)
Finally, we can step beyond marker gene analysis, and use some ‘latent space’ discovery methods to learn patterns of co-regulated gene expression.
These patterns can be used to identify/define: * Cell type identities * Biological processes * Spatial gradients * Other cellular features
… often with significantly greater resolution and precision than marker genes.
Importantly, these patterns are ‘data driven’ and often yield insights into the heterogeneity and complexity of a given dataset that were unanticipated.
nPatterns<-30
# Takes about ~3-4 minutes...
system.time(dat.nnmf<-nnmf(as.matrix(log10(exprs(dat)[expressed_genes,]+1)), k = nPatterns, alpha = rep(0,3), beta = rep(0,3), method = c("scd"), loss = c("mse"),
init = NULL, mask = NULL, W.norm = -1L, check.k = TRUE, max.iter = 500L, rel.tol = 1e-4,
n.threads = 6, trace = 10, verbose = TRUE, show.warning = TRUE))## user system elapsed
## 448.452 21.551 142.656# Gene x Pattern matrix
dim(dat.nnmf$W)## [1] 14241 30# Pattern x Cell matrix
dim(dat.nnmf$H)## [1] 30 5537#Add patterns to phenotype data for visualization
patterns.df<-data.frame(t(dat.nnmf$H))
colnames(patterns.df)<-paste0("Pattern_",c(1:nPatterns))
pData(dat)<-cbind(pData(dat),patterns.df)
pdf("figures/patterns.pdf",width=10,height=10)
lapply(c(1:nPatterns),function(i){
plot_cell_clusters(dat, color=paste0("Pattern_",i), cell_size=cell_size) +
ggtitle(paste0("Pattern_",i)) +
scale_colour_viridis() +
coord_equal(1)
})## [[1]]##
## [[2]]##
## [[3]]##
## [[4]]##
## [[5]]##
## [[6]]##
## [[7]]##
## [[8]]##
## [[9]]##
## [[10]]##
## [[11]]##
## [[12]]##
## [[13]]##
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## [[17]]##
## [[18]]##
## [[19]]##
## [[20]]##
## [[21]]##
## [[22]]##
## [[23]]##
## [[24]]##
## [[25]]##
## [[26]]##
## [[27]]##
## [[28]]##
## [[29]]##
## [[30]]dev.off()## quartz_off_screen
## 2i<-21
plot_cell_clusters(dat, color=paste0("Pattern_",i), cell_size=cell_size) +
ggtitle(paste0("Pattern_",i)) +
scale_colour_viridis() +
coord_equal(1)
Genes associated with learned patterns
geneWeights.df<-data.frame(dat.nnmf$W)
colnames(geneWeights.df)<-paste0("Pattern_",c(1:nPatterns))
#fData(dat)[head(rownames(dat.nnmf$W)[order(dat.nnmf$W[,patternOfInterest],decreasing=TRUE)]),]
tmp<-merge(fData(dat)[,c("gene_id","gene_short_name")],geneWeights.df,by=0)
DT::datatable(tmp[,-1])## Warning in instance$preRenderHook(instance): It seems your data is too
## big for client-side DataTables. You may consider server-side processing:
## https://rstudio.github.io/DT/server.htmlLets see how these patterns learned directly from the data correlate with annotated features
featuresOfInterest<-c("library_id","Genotype","Sex","num_genes_expressed","CellType")
phenoMat<-pData(dat)[,featuresOfInterest]
phenoMat$library_id<-as.numeric(phenoMat$library_id)
phenoMat$Genotype<-as.numeric(factor(phenoMat$Genotype))
phenoMat$Sex<-as.numeric(factor(phenoMat$Sex))
phenoMat$CellType<-as.numeric(factor(phenoMat$CellType))
for (a in levels(pData(dat)$library_id)){
phenoMat[[paste("library_",a,sep="")]]<-as.numeric(factor(pData(dat)$library_id)==a)
}
for (a in levels(pData(dat)$Genotype)){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$Genotype==a)
}
for (a in levels(pData(dat)$Sex)){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$Sex==a)
}
for (a in levels(factor(pData(dat)$CellType))){
phenoMat[[a]]<-as.numeric(pData(dat)$CellType==a)
}
patternPhenoCor<-cor(phenoMat,patterns.df,method="spearman")
#phenoCorTest<-cor.test(phenoMat,dat.pca$x)
patternPhenoCor.melt<-melt(patternPhenoCor)
patternPhenoCor.melt$class<-"Other"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% paste("library_",levels(factor(pData(dat)$library_id)),sep="")]<-"library"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$CellType))]<-"Cell Type"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$Genotype))]<-"Genotype"
patternPhenoCor.melt$class[patternPhenoCor.melt$Var1 %in% levels(factor(pData(dat)$Sex))]<-"Sex"
#col.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(t(patternPhenoCor)))))
col.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(t(patternPhenoCor[rownames(patternPhenoCor) %in% levels(factor(pData(dat)$CellType)),])))))
row.order<-order.dendrogram(as.dendrogram(hclust(dist(patternPhenoCor))))
patternPhenoCor.melt$Var2<-factor(patternPhenoCor.melt$Var2,levels=colnames(patternPhenoCor)[col.order])
patternPhenoCor.melt$Var1<-factor(patternPhenoCor.melt$Var1,levels=rownames(patternPhenoCor)[row.order])
p<-ggplot(patternPhenoCor.melt)
p<- p + geom_tile(aes(x=Var2,y=Var1,fill=value)) +
scale_fill_gradient2(low="steelblue",mid="white",high="tomato") +
theme(axis.text.x=element_text(angle=-90)) +
ggtitle("Pattern:Phenotype Correlation") + xlab("Pattern") + ylab("Feature") +
coord_equal()
p
#pdf(paste0("projections/cut",cut,"/Projected_pattern_pheno_correlations.pdf"),width=30,height=15)
#p + theme(axis.text.x=element_text(angle=-45, hjust=0))
#dev.off()Exploratory Analysis
Never underestimate the power of exploratory data analysis. Here’s a snapshot of the full dataset in a low-latency scRNA-Seq exploration tool being developed by the Chan Zuckerberg Initiative in conjunction with the Human Cell Atlas project.
Interactive dataset browser: http://neurocoglab.gofflab.org
Session Information
sessionInfo()## R version 3.5.1 (2018-07-02)
## Platform: x86_64-apple-darwin15.6.0 (64-bit)
## Running under: macOS High Sierra 10.13.6
##
## Matrix products: default
## BLAS: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.5/Resources/lib/libRblas.0.dylib
## LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/3.5/Resources/lib/libRlapack.dylib
##
## locale:
## [1] en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8/C/en_US.UTF-8/en_US.UTF-8
##
## attached base packages:
## [1] splines stats4 parallel stats graphics grDevices utils
## [8] datasets methods base
##
## other attached packages:
## [1] bindrcpp_0.2.2 ggrastr_0.1.7 DT_0.5
## [4] reshape2_1.4.3 viridis_0.5.1 viridisLite_0.3.0
## [7] NNLM_0.4.2 dplyr_0.7.8 gridExtra_2.3
## [10] pheatmap_1.0.12 VGAM_1.0-6 reticulate_1.10
## [13] monocle_2.99.3 L1Graph_0.1.1 lpSolveAPI_5.5.2.0-17
## [16] DDRTree_0.1.5 irlba_2.3.3 igraph_1.2.3
## [19] DelayedArray_0.6.6 BiocParallel_1.14.2 IRanges_2.14.12
## [22] S4Vectors_0.18.3 matrixStats_0.54.0 stringr_1.4.0
## [25] cellrangerRkit_2.0.0 Rmisc_1.5 plyr_1.8.4
## [28] lattice_0.20-35 bit64_0.9-7 bit_1.1-14
## [31] ggplot2_3.1.0 RColorBrewer_1.1-2 Biobase_2.40.0
## [34] BiocGenerics_0.26.0 Matrix_1.2-14
##
## loaded via a namespace (and not attached):
## [1] Rtsne_0.15 colorspace_1.4-0
## [3] deldir_0.1-16 rprojroot_1.3-2
## [5] listenv_0.7.0 ggrepel_0.8.0
## [7] codetools_0.2-15 docopt_0.6.1
## [9] doParallel_1.0.14 knitr_1.21
## [11] jsonlite_1.6 Cairo_1.5-9
## [13] cluster_2.0.7-1 shiny_1.2.0
## [15] compiler_3.5.1 httr_1.4.0
## [17] backports_1.1.2 assertthat_0.2.0
## [19] lazyeval_0.2.1 limma_3.36.5
## [21] later_0.7.5 htmltools_0.3.6
## [23] tools_3.5.1 coda_0.19-2
## [25] gtable_0.2.0 glue_1.3.0
## [27] RANN_2.6.1 gmodels_2.18.1
## [29] Rcpp_1.0.0 slam_0.1-44
## [31] spdep_0.8-1 gdata_2.18.0
## [33] nlme_3.1-137 DelayedMatrixStats_1.2.0
## [35] iterators_1.0.10 crosstalk_1.0.0
## [37] xfun_0.4 globals_0.12.4
## [39] mime_0.6 miniUI_0.1.1.1
## [41] gtools_3.8.1 future_1.11.1.1
## [43] LearnBayes_2.15.1 MASS_7.3-51
## [45] scales_1.0.0 promises_1.0.1
## [47] rhdf5_2.24.0 expm_0.999-3
## [49] yaml_2.2.0 pbapply_1.4-0
## [51] fastICA_1.2-1 stringi_1.2.4
## [53] foreach_1.4.4 densityClust_0.3
## [55] boot_1.3-20 manipulateWidget_0.10.0
## [57] spData_0.3.0 rlang_0.3.1
## [59] pkgconfig_2.0.2 rgl_0.99.16
## [61] qlcMatrix_0.9.7 evaluate_0.12
## [63] purrr_0.3.0 Rhdf5lib_1.2.1
## [65] bindr_0.1.1 labeling_0.3
## [67] htmlwidgets_1.3 tidyselect_0.2.5
## [69] magrittr_1.5 R6_2.4.0
## [71] pillar_1.3.1 withr_2.1.2
## [73] sp_1.3-1 tibble_2.0.1
## [75] crayon_1.3.4 plotly_4.8.0
## [77] rmarkdown_1.10 grid_3.5.1
## [79] data.table_1.12.0 FNN_1.1.2.2
## [81] HSMMSingleCell_0.114.0 sparsesvd_0.1-4
## [83] digest_0.6.18 webshot_0.5.1
## [85] pbmcapply_1.3.1 xtable_1.8-3
## [87] tidyr_0.8.2 httpuv_1.4.5.1
## [89] munsell_0.5.0 glmnet_2.0-16Knit Time
With caches
knitEnd <- Sys.time()
knitEnd - knitStart## Time difference of 4.820486 mins